Osmanlı padişahlarının on beşincisi ve İslam halifelerinin seksenincisidir. 1591 senesinde Manisa'da doğdu. Her şehzade gibi iyi bir eğitim gördü. Ağabeyi birinci Ahmed Hanın vefatı üzerine 22 Kasım 1617 de ilk defa ekberiyet kaidesine göre, yani hanedanın en yaşlı mensubu olarak zorla tahta çıkarıldı. Sultan Mustafa Han, devlet meseleleriyle ilgilenmediğini ifade ederek saltanatı kabul etmediyse de bu hâl devlet erkanınca göz önüne alınmadı.

Ancak çok geçmeden devlet işlerinde sultanın yabancı kalması ve işlerin karışması üzerine, durumun böyle devam edemeyeceğini anlayan devlet adamları hal'ine fetva aldılar ve 26 Şubat 1618 günü Sultan Mustafa'yı tahttan indirerek yerine Genç Osman'ı çıkardılar.

Ancak yenilik taraftarı olmayanların tahrikleri neticesinde isyan eden yeniçeriler 19 Mayıs 1622 de Genç Osman'ı tahttan indirdiler. Bu durum Sultan Mustafa'nın ikinci defa tahta geçirilmesine yol açtı. Bu sırada Sultan Osman Hanın veziriazam Kara Davud paşa tarafından şehit ettirilmesi büyük karışıklıklara sebep oldu. Sultan Mustafa Han, Davud paşayı azlederek yerine Mere Hüseyin paşayı getirdiyse de, isyanlar son bulmadı. Erzurum Beylerbeyi Abaza Mehmed paşa başkaldırarak, bölgesindeki yeniçerilerin bir kısmını öldürttü. ''Genç Osman'ın intikamını alacağım'' diye and içen Abaza, İstanbul'a gelmek için yola çıktı. Bursa’yı muhasara ettiyse de alamadı. Kış geldiği için Niğde'ye çekildi.

Anadolu'daki isyanlar ve Genç Osman’ın şehit edilmesi olayına adı karışan sipahiler, halk nezdinde kazandıkları nefreti silmek için bir divan toplantısı sırasında ayaklanarak Sultan Osman Hanın katillerinin bulunmasını istediler. Bunun üzerine Kara Davud paşa ve Kalenderoğlu denilen kişiler yakalanarak idam edildiler.

Diğer taraftan Osmanlı Devletinin iç karışıklıklarından istifade etmek isteyen Lehistan kazakları, daha önce imzalanan antlaşma şartlarına uymayarak, şayka adı verilen yüz elli civarında küçük gemiyle Osmanlı kıyılarına saldırdılar. Kazakların üzerine gönderilen Karadeniz serdarı Damad Receb paşa, kazakları takip ederek Kilgra önünde birçok gemilerini batırdı ve 21 gemiyi zaptederek beş bin esirle İstanbul'a döndü.

İstanbul'da vukubulan karışıklıklar ve Anadolu'da meydana gelen isyanlar, Osmanlı Devletinin başında daha kudretli, azimkâr ve zeki bir padişahın bulunmasını gerekli kılıyordu. Bu sebeple 1623 de sadarete getirilen Kemankeş Ali paşa, Şeyhülislam Yahya Efendi ve diğer devlet erkanı toplanarak Sultan Mustafa'nın artık makam-ı saltanatta kalmaması gerektiği hususunda karara vardılar. Nitekim verilen fetva ile 10 Eylül 1623 günü Sultan Mustafa, ikinci defa tahttan indirildi ve yerine dördüncü Murad Han geçti.

Sultan Mustafa Han, zayıf ve narin vücutlu idi. Yüzü her zaman solgun olup, üzüntülü bir görünüşü vardı. Son derece dindardı. Sık sık türbeleri ziyaret eder ve çokça sadaka dağıtırdı. Saraydaki hayatını ibadet içinde, dini eserler ve Kur'an-ı kerim okuyarak geçirirdi. Saltanatta gözü olmadığı için her iki hal'inde de en küçük bir memnuniyetsizlik göstermemiş, tahttan sevinçle inmiştir. 20 Ocak 1639 günü Topkapı Sarayında vefat eden Sultan Mustafa Han, Ayasofya Camii karşısındaki türbesinde medfundur.